13.03.2002 Введение в генную терапию

К. С. Келли
Лечение гемофилии. Серия монографий. №17. Всемирная федерация гемофилии 1999, пересмотренное и исправленное издание 2000 года.
Первоначально данная статья была напечатана в издании "Келли Комьюникейшнс" ПЭН.
Исправления и перепечатка производятся с разрешения автора.

Активные исследования, ведущиеся гемофилическим сообществом в областях, касающихся препаратов крови и их безопасности, дают всеобъемлющую информацию по данным вопросам. Но проблемы, связанные с генной терапией не были исследованы столь досконально. Генная терапия не проста для понимания, но, в конечном счете, она оказывает значительное влияние на нашу жизнь. И, как в случаях с другими вопросами, касающимися лечения гемофилия, мнения относительно ее преимуществ и недостатков неизбежно рознятся, особенно на ранних стадиях генной терапии.

Если исследования продолжатся в текущем темпе, мы, вероятно, сможем делать выбор относительно генной терапии в ближайшем будущем. Мы сможем решить множество сложных вопросов, и тогда рассматривать генную терапию для нас и наших детей. Для принятия оптимального решения мы нуждаемся, по крайней мере, в основном понимании генной терапии.

Помимо основного понимания, мы должны быть в курсе различных программ генной терапии, находящихся на стадии разработки, и главных препятствий на пути их осуществления. Наконец, мы должны смотреть в будущее исследований в области генной терапии и их влияния на гемофилию, и научиться смотреть на развитие терапии с критической точки зрения.

Основные принципы генной терапии

Лечение гемофилия путем генной терапии подразумевает исправление генетических дефектов больного путём размещения нормально функционирующих генов в его клетки. Нормальные гены, отвечающие за выработку факторов VIII и IX, должны быть внедрёны в достаточное количество клеток, чтобы позволить организму пациента поддерживать необходимый уровень фактора, т. е. излечить его от гемофилии.

Генная терапия - не новое решение, ученые размышляли относительно возможностей генной терапии ещё 30 лет назад, но в то время возникало множество технических препятствий на пути серьезного изучения данного вопроса. Некоторые из этих препятствий были преодолены, другие остаются наряду с возникшими новыми проблемами.

Первоначально, ученые были должны выяснить, каким образом лучше отделить ген от одной клетки и поместить его в другую. Эта проблема была решена многими компаниями и исследовательскими лабораториями, разрабатывающими рекомбинантные препараты, например инсулин, гормоны роста, интерферон и фактор VIII; и учеными, осуществляющими фундаментальные исследования в области генной инженерии. За прошедшие 30 лет, методы извлечения гена и размещения его в клетке получили развитие до такой степени, что теперь эта операция может проводиться в университетских лабораториях и даже некоторых средних школах.

В то время как основы техники по переносу генов легко выполнимы, успешное применение генной терапии требует намного большего, чем обозначено в таблице 1, и имеет некоторые определенные необходимые условия:

1. передаваемый ген должен быть помещен в клетке, где эффективно будет функционировать. Некоторые болезни, например, кистозный фиброз, требуют, чтобы ген был помещен в ткани легких. При гемофилии, ген должен быть помещен в клетки, которые доставят факторы VIII или IX в систему кровообращения.
2. Однажды перенесённый ген должен функционировать в клетке в течение длительного времени, в идеале, постоянно. Или клетки с новым геном, названным приемными клетками, должны самостоятельно выживать в течение длительного времени, или они должны передать ген будущим поколениям клеток. Преследуемая цель не выполнена, если ген, трансплантированный в клетку, погибает в течение короткого промежутка времени.
3. Недавно переданный ген, называемый трансгеном, должен быть должным образом выражен, то есть он должен производить достаточное количество фактора для адекватного свертывания крови.
4. Передача гена не должна повреждать нормальной ДНК. Если ген неправильно введён в ДНК, другие гены могут быть нарушены, или обычно "тихие" гены могут быть возбуждены, что потенциально может приводить к развитию рака и другим аномальным изменениям клетки. Цель состоит в том, чтобы добавить новую способность (вырабатывать фактор) без изменения любых других функций клетки.
5. Передача гена не должна приводить к иммунной реакции, ограничивающей эффективность гена, предотвращая лечение в будущем, или вызывать серьезные побочные влияния.
6. Процесс передачи должен быть един для любых больных гемофилией, относительно прост в применении и эффективен для всех.

Таблица 1.
Для успешной генной терапии

Эти необходимые условия для успешной генной терапии при гемофилии основываются на двух ключевых медицинских положениях: безопасность и эффективность. Безопасность подразумевает отсутствие ущерба для здоровья пациента; эффективность означает, что кровь больного эффективно свертывается. Практически, успех также зависит от реализуемости и доступности. Сможете ли вы позволить себе применение генной терапии, и будет ли она доступна всем нуждающимся в ней?

Лечение обычной инъекцией?
Два типа генной терапии

Все программы генной терапии могут быть разделены на два вида: те, где передача гена происходит внутри больного (in vivo) и где генная передача происходит вне больного (ex vivo).

Терапия in vivo основывается на способности клеток абсорбировать ДНК. Исследователи надеются упаковывать нормально функционирующий ген так, чтобы позволит клетке без труда принять его, позволяя передачу гена, возможно обычной инъекцией.

При переносе ex vivo, нормально функционирующий ген будет вначале перенесён в клетку в лаборатории. Затем клетки с недавно переданным геном могут быть внедрены в больного. Таким образом, будет возможно использовать собственные клетки пациента.

Какой подход лучше? В обоих имеются свои преимущества и недостатки. Преимущество метода in vivo - то, что это требует относительно небольших лабораторных манипуляций, и может использоваться в широком диапазоне. Если будет найден успешный метод, доставки гена в необходимую клетку больного, перенос in vivo, вероятно подразумевал бы, простую. Напротив, Ex vivo передача требует больше "хирургической" работы, в частности, удаления и обратного вживления клетки. Это также требует большего количества лабораторной работы: чтобы провести пересадку гена, необходимо вначале проследить за ростом и развитием клетки, подвергнутой трансфекции, и проанализировать полученные данные перед пересадкой. Ex vivo терапия требует более персонифицированного подхода, в то время как "in vivio" может проводиться в "массовым производством". С деловой точки зрения, обычно желательно разработать программу или процесс, который не требует отладки каждый раз заново; много компаний предпочли бы подход "in vivo".

Но в методе ex vivo имеются потенциальные преимущества. Введение генов в лаборатории может быть выполнено при использовании простых физических методов, в отличие от "in vivo". Один из таких методов, электропорация, пропускает электрический ток сквозь клетки, открывая их наружные стенки, и позволяет ввести ДНК. Индивидуальные клетки, или клоны, с наиболее желательными характеристиками могут тогда быть изолированы, размножены в лаборатории; и повторно внедрены в больного. Хотя эта методика более трудоемка, чем передача "in vivo", она значительно более безопасна и легче поддается контролю.

Однако многих экспертов волнует тот факт, что методы ex vivo слишком громоздки, или не могут генерировать достаточное количество клеток, необходимых, чтобы обеспечить нормальный уровень фактора в крови. Да и последние исследования свидетельствуют в пользу передачи in vivo. Если больной будет использовать "in vivo" передачу в будущем, как это будет работать? Какой вид инъекции может разместить новый ген?

Вирусы могут быть полезны: передача "in vivo"

Внедрение нового гена представляет определенные трудности; ДНК, материал, из которого сделаны гены, нельзя просто проглотить подобно пилюле или даже ввести в кровь. Незащищенная ДНК в организме, вероятно, просто разрушится, а оставшееся количество ДНК не сможет быть эффективно распознано и поглощено клеткой. Незащищенная ДНК, несущая набор инструкций по нормальному свертыванию крови, нуждается в векторе, переносчике в нужные клетки организма больного. Наиболее распространенные векторы для передачи гена - вирусы.

Почему вирусы? Вирусы могут быть вредны, даже смертельны. Но вирусы - хорошие кандидаты на роль вектора, потому что они структурно просты, обычно состоят из малых частей ДНК, РНК и нескольких белков. Они также довольно просты в изучении, могут быть наследственно изменены, и иметь естественную склонность присоединяться к определенным типам клеток и передавать свою ДНК в эти клетки.

Однако прежде, чем вирусный вектор начнет использоваться, он должен быть полностью испытан, чтобы избежать нежелательных побочных эффектов. Некоторые векторы, выделенные из штаммов, считаются безопасными. Но другие, получены из потенциально опасных вирусов, включая ВИЧ. Исследователи должны придерживаться четкого курса между наличием изменяемого вируса, который может эффективно доставлять ген, нуждающейся клетке избегая любого вреда, приносимого самим вирусным вектором. Но безопасность должна быть превыше всего; потенциально вредные вирусы, рассматриваемые в роли вектора, обычно подвергаются модификации и приводятся в безопасное состояние, при этом, сохраняя способность переносить ДНК в нужную клетку.

Различные типы вирусных векторов имеют свои преимущества и недостатки. Пока среди ученых не достигнуто единого мнения относительно того, какой тип вектора является лучшим для генной терапии при гемофилии. Если метод генной терапии "in vivo" станет методом лечения гемофилии, разработка идеального вектора будет одной из основных задач.

Изучаются и другие методы in vivo, которые не используют вирусные векторы. Некоторые исследователи пытаются заключить ДНК внутрь липидной оболочки, чтобы предохранить ее от разрушения до тех пор, пока она не будет воспринята клеткой. Этот подход, содержит меньший риск, чем вирусные векторы, но вероятно является также менее эффективным, и новая ДНК может быть потеряна через какое-то время. Другой изучаемый подход подразумевает соединение гена с другим компонентом, типа белка, который также имеет способность связывать себя с некоторыми клетками. Эти невирусные векторы, возможно менее опасны, чем вирусы, но в настоящее время не работают также эффективно.

Вирусный или невирусный вектор использовать, как долго недавно созданный ген проживет в организме? Как долго это лечение продлится?

На какое время можно "вылечить" больного гемофилией?

Пока "успех" программ генной терапии остается кратковременным; собака, больная гемофилия была "вылечена" на период 30 дней, а затем симптомы заболевания вернулись. С человеком, который будет излечен "на годы " или навсегда, неизбежно должны произойти 2 вещи:

1. переданный ген должен оставаться устойчивым и функционировать внутри клетки;
2. сами клетки должны продолжать функционировать.
3. Приживется ли ген в клетке после передачи, будет зависеть от используемого вектора; некоторые векторы могут встраивать свою ДНК, это означает, что переданная ДНК становится физически соединенной с ДНК клетки пациента. Это может способствовать долговременной стабильности, так как перенесённый ген будет копироваться всякий раз, когда ДНК клетки копируется. Другие векторы не присоединяют, перенесенную ДНК к ДНК клетки пациента.

Поэтому, когда клетки обычно делятся, перенесённая ДНК с исправленными функциями свертывания крови может не воспроизводиться. В этом случае клетки больного гемофилией, в конечном счете, теряют способность к свертыванию крови. Однако, даже с этим невстроенным вектором, ДНК может препятствовать болезни в течение многих месяцев или даже лет, что можно расценивать как кратковременное излечение. Такие кратковременные эффекты могут быть даже более предпочтительны, потому что при этом и любые негативные побочные эффекты также временны.

Прежде всего, для самой клетки необходимо оставаться здоровой. Многие клетки в теле человека живут недолго, постоянно отмирая, поскольку создаются новые клетки. В то время как некоторые из быстро делящихся клеток легко соединяются с новым геном, они не подходят для длительной генной терапии, если передачи гена новому поколению клеток не происходит. Один путь состоит в том, чтобы поместить нормально функционирующий ген в клетки, с продолжительным сроком жизни, например, клетки мышц или печени. Но даже эти клетки могут, в конечном счете, терять введенный ген, приводя к постепенному снижению свертывающей способности крови.

Долговременного излечения можно достичь, если найти "правильную" клетку, однако при этом требуется преодолеть ряд опасностей.

Опасности генной терапии

Наиболее очевидная опасность генной терапии состоит в том, что вирусные векторы будут действовать как вирусы, сохраняя или восстанавливая их способность вызвать инфекции. К счастью, большинство исследуемых вирусных векторов или не вызывают заболеваний у человека, или были обезврежены с помощью генной инженерии.
Вторая, более комплексная опасность - риск того, что генная терапия стимулирует иммунную систему человека в направлении уменьшения эффективности терапии, или затруднит проведение терапии в будущем. Наша иммунная система становится более эффективной против инородных белков и ДНК, при столкновении с ними во второй или третий раз. Представьте, как работают прививки: первичное введение подвергает нас воздействию вируса полиомиелита, например, и настраивает нашу иммунную систему на противодействие этому вирусу, если тот попадает в нашу кровь в будущем. Точно так же иммунная система некоторых людей, больных гемофилией, образует ингибиторы к факторам. После лечения фактором, который является инородным многим больным, тяжелой формой гемофилии "A", организм настраивается на отторжение фактора всякий раз, когда он снова попадает в кровь.

Если при гемофилии используется генная терапия, все вирусные векторы, вероятно, вызовут некоторую иммунную реакцию. Но некоторые векторы могут быть более активны, чем другие. Действительно, наша иммунная система может быть уже предрасположена, чтобы воздействовать на определенные специфические вирусы. Например, одна из проблем, связанная с векторами, полученными из аденовируса (вирус простуды) то, что большинство из нас неоднократно простывали, и уже готовы противостоять этому; в результате наша иммунная система в состоянии обезвредить аденовирусные векторы. Но даже если векторы не были атакованы иммунной системой при первом курсе терапии, это может стимулировать иммунную систему на выработку антител уже во время следующего курса лечения.

И, если генная терапия гемофилии не гарантирует постоянного выздоровления, процедура периодически должна повторяться. Таким образом, ученым необходимо найти способ преодолеть реакцию иммунной системы на гены-имплантанты.

Третий существенный риск генной терапии гемофилии возможность при имплантации больному нового гена с командами свертывания разрыва связей других генов в той клетке, следствие случайное включение или формирование генов рака. Это может быть особенно актуальным при использовании интегрированных вирусных векторов.

Такое произвольное включениевыключение может быть латентно в течение многих лет, так что невозможно оценить, являются ли генетические "переключения" зависимыми в течение какого-то времени от генной терапии. Насколько это серьезная угроза? Мы ещё не знаем, как и когда новые технологии решат эту проблему.

Текущие программы в генной терапии

Благая весть для людей, больных гемофилия и их семей, что многочисленные исследовательские лаборатории занимаются исследованиями по разработке методов генной терапии для лечения гемофилия и изучением биохимии факторов свертывания крови. Эта работа, несомненно, приведет к более полному пониманию того, как генная терапия может влиять на гемофилию. Правительственные структуры, частные компании, больницы и университеты проводят исследования в области генной терапии.

Где находятся эти лаборатории?
На январь 2000 три клинических эксперимента получили своё начало в Соединенных Штатах, два с гемофилией "А" и один с гемофилией "B" (Таблица 2).

В 1999, три отдельных клинических эксперимента начались в Соединенных Штатах, которые используют подходы генной терапии к исправлению гемофилии. Все испытания находятся в стадии испытания, это означает, что главная цель состоит в том, чтобы определить, действительно ли эти методы достаточно безопасны, чтобы провести более обширное испытание, которое необходимо, чтобы определить, как эффективно эти методы могут фактически улучшить функцию свертывания. В результате, каждое испытание будет вероятно длиться в течение 1-2 лет, перед переходом к следующей стадии испытания.

Другие исследовательские программы находятся еще на доклинической стадии разработки. Предварительные результаты испытаний многообещающи, и ряд экспертов утверждает, что гемофилия может быть первым генетическим заболеванием, которое будет вылечено с помощью генной терапии.

Но не спешите в ваш центр гемофилии. Хотя клинические эксперименты на человеке уже начались, они пока напрямую не могут привести к излечению. Помните, что когда рекомбинантый фактор VIII был на клинических испытаниях, было относительно просто сравнить его эффективность с эффективностью препаратов, полученных из плазмы крови. Большая часть работы с рекомбинантыми препаратами была окончена еще до начала клинических экспериментов. Клинические испытания генной терапии невозможно элементарно интерпретировать. Невозможно знать точно, как программы генной терапии будут работать на конкретных людях до проведения экспериментальных действий. Клинические эксперименты могут стать ареной, на которой столкнутся множество этических, медицинских и финансовых проблем. Вот почему настолько трудно составить расписание для разработки генной терапии для лечения гемофилии.

Будущее генной терапии

Будет ли доступна генная терапия для наших детей? Да, но возможно когда они уже не будут детьми. Генная терапия не развивается так быстро, как предсказывали многие ученые, но все же имеется постоянный прогресс, и пока нет никаких непреодолимых препятствий. Однако сложность и специфика генной терапии состоит в том, что надо сделать одно, и только одно уникальное изменение в генетической и метаболической структуре пациента. Места для погрешности чрезвычайно мало.

Трудно предсказать, когда генная терапия будет доступна, но одна вещь очевидна: чем больше вы читаете и понимаете, тем лучше вы будете подготовлены. Внезапный прорыв в исследованиях может позволить нам всем принять решение, которое навсегда изменит наши жизни.